本发明提供了一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺。该工艺先将棕榈粕润水、蒸煮、冷却,再利用能够表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母培养液处理棕榈粕,再接种沪酿3.042号米曲霉培养制得成曲;成曲加2.5倍量的20°Be?盐水,天然晒制发酵30~100天,淋头油,保温,沉淀,即得到成品酱油。经过测定,所得酱油氨基酸态氮含量为1.100g/100mL~1.156g/100mL,全氮含量为1.90g/100mL~1.99g/100mL,氨基酸生成率为56.38%~60.63%,表明经处理后的棕榈粕可以作为酱油的发酵选择原料,棕榈粕产量大、安全性高、价格低廉,扩展了棕榈粕的应用,实现其价值最大化。
1.棕榈粕在制备酱油中的应用。
2.一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,其特征在于,是以能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液处理过的棕榈粕为原料,接种米曲霉制曲,再经过发酵,即得到酱油。
3.根据权利要求2所述以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,其特征在于,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液;S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.55xa0mL~0.95mL/g的水,混匀润水30~60min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮25~45min,趁热摇散、冷却;S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入10%~50%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:以棕榈粕干料计,按照0.05%~0.1%的质量比,接种米曲霉,混匀,于30±1°C继续培养36~72h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵30~100天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,可获得S5中20°Be?盐水重量50%~80%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀4~7天,过滤,得到成品酱油。
4.根据权利要求3所述以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,其特征在于,S1所述能够表达β-甘露聚糖酶的酵母为工程菌毕赤酵母X33/pGAPZαA-man26A。
5.根据权利要求3所述以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,其特征在于,S1所述获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液的发酵条件为:29±1°C,250rpm,发酵48~84h。
6.根据权利要求3所述以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,其特征在于,S4所述米曲霉为沪酿3.042号米曲霉。
7.根据权利要求3所述以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,其特征在于,S5所述天然晒制是在10~40°C的露天环境下的水泥池或玻璃钢酱油发酵罐中进行的。
8.根据权利要求2~7任一所述工艺制备得到的酱油。技术领域
本发明属于生物工程技术领域。更具体地,涉及一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺。
背景技术
棕榈粕亦称“油棕仁渣”或“棕榈仁渣”,英文名为“Palmxa0Kernelxa0Cake”或“Palmxa0Kernelxa0Meal”(机械压榨法得到的英文称为Palmxa0Kernelxa0Cake,简称PKC;溶剂萃取法得到的英文称为Palmxa0Kernelxa0Meal,简称PKM)。它是在榨压棕榈仁时,除去棕仁油的剩余物,初呈黑色泥块状,经去除杂质和控制水分加工处理后呈褐色小颗粒状,其形状、颜色与菜子粕相似,略有巧克力气味。棕榈粕主要产地:马来西亚、印度尼西亚。主要加工出口地:马来西亚。棕榈粕的主要化合物组成如下:棕榈粕粗蛋白质含量为14%~21%,粗纤维21%~23%;棕榈粕的总碳水化合物(木质素除外)含量约50%,其中只有2.4%是小分子碳水化合物,1.1%是淀粉,而剩下的42%是以非淀粉多糖(NSPs)的形式存在,也就是说棕榈粕的81%的碳水化合物以非淀粉多糖形式存在,而非淀粉多糖又主要以不溶性的非纤维素多糖为主,占干物质的33.6%,可溶性非纤维素多糖主要由甘露糖和半乳糖组成,而不溶性非纤维素多糖中主要含甘露糖和葡萄糖。非淀粉多糖中xa078%是直链甘露聚糖(含有很少量的半乳糖)、12%的纤维素、3%的葡萄糖醛酸木聚糖和3%的阿拉伯木聚糖。总之,棕榈粕不仅含有多种氨基酸,较高的能值蛋白质,还含有矿物质,维生素B、E,锰,钾,且每年产量有几百万吨,一般无黄曲霉毒素污染,作为饲料原料在国外畜牧行业已经应用多年。棕榈粕经高温后杀灭各种细菌,无污染,而且高温高压后营养组织重新组合,提高了蛋白质和脂肪酸的品质。它的水分低于12%,耐储存,放置安全,储存时间长达10个月。目前在我国,也大都只是应用于畜牧行业做饲料用,开发利用空间巨大。另外,目前传统的酱油生产工艺主要用的是植物性蛋白质和淀粉质原料,植物性蛋白质原料主要是溶剂浸出油脂后的豆粕,或大豆榨油后剩余的豆饼;淀粉质原料主要是小麦及麸皮,也有以碎米和玉米代用。并且酱油制作主要以非转基因豆粕和大豆为原料,大豆蛋白质含量约为38%~40%,但是价格较高,故以豆粕为制作酱油的主要原料,而单纯以豆粕为原料制曲很困难,一般与麸皮按6:4的比例混合制曲;豆粕粗蛋白质含量约为42%~45%,加入麸皮后混合原料蛋白质含量降为约30%。但是,目前未见有以棕榈粕为原料来制备酱油的相关研究。
发明内容
xa0本发明所要解决的技术问题是克服现有酱油制备工艺的局限和不足,提供一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺。利用所述工艺制备酱油的氨基酸消化率高、产量大、安全性高、价格低廉。本发明的目的是提供一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺。本发明的另一目的是提供一种利用上述工艺制备得到的酱油产品。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:本发明提供棕榈粕在制备酱油中的应用。提供了一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺,是以能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液处理过的棕榈粕为原料,接种米曲霉制曲,再经过发酵,得到酱油。所述以棕榈粕为原料制备酱油的工艺的具体步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液;S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.55mL~0.95mL/g的水,混匀润水30~60min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮25~45min,趁热摇散、冷却;S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入10%~50%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:以棕榈粕干料计,按照0.05%~0.1%的质量比,接种米曲霉,混匀,于30±1°C继续培养36~72h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵30~100天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,可获得相当于S5中20°Be?盐水重量50%~80%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀4~7天,过滤,得到成品酱油。优选地,S1所述能够表达β―甘露聚糖酶的酵母为工程菌毕赤酵母X33/xa0pGAPZαA-man26A。xa0xa0优选地,S1所述获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液的发酵条件为:29±1°C,250rpm,发酵48~84h。xa0优选地,S4所述米曲霉为沪酿3.042号米曲霉。优选地,S5所述天然晒制是在10~40°C的露天环境下的水泥池(上铺人字型玻璃)或玻璃钢酱油发酵罐中进行的。特别地,S1所述能够表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌不仅限于毕赤酵母X33/pGAPZαAxa0-man26A,还包括以pGAPZαA为表达载体和其它毕赤酵母表达系统构建的表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌。同时根据上述工艺制备得到的酱油也在本发明的保护范围之内。利用本发明所述工艺条件制备得到的酱油头油质量指标如下:氨基酸态氮含量(AN)为1.100g/100mL~1.156g/100mL,全氮含量为1.90g/100mL~1.99g/100mL,氨基酸生成率为56.38%~60.63%。本发明经过测定,棕榈粕蛋白质含量为21%~28%,虽然低于豆粕粗蛋白质含量(42%~45%),但与加入麸皮后混合原料的蛋白质含量(约30%)比较接近,棕榈粕的大部分氨基酸消化率高于85%,安全性高(不含黄曲霉毒素和其它有毒物质),特别是产量大、价格低廉。另一特点是甘露聚糖水解产物―甘露寡糖属于功能性低聚糖,具有一定的免疫原性,能刺激机体免疫应答,增强动物体的细胞和体液免疫反应,将其用于酱油制作既具有经济价值,也具有社会价值。将棕榈粕用于酱油制作的技术障碍是棕榈粕的81%的碳水化合物以非淀粉多糖形式存在,而非淀粉多糖又主要以不溶性的非纤维素多糖为主,占干物质的33.6%,这些物质的存在使酱油生产菌种米曲霉在棕榈粕上生长繁殖不良,且只在表面生长,难以透入原料内部。另外,棕榈粕是否能应用于酱油制备,要从以棕榈粕为原料制备出来的酱油的氨基酸态氮和总氮含量两方面来考察。要提高氨基酸态氮和总氮含量必须首先水解占非淀粉多糖78%的直链甘露聚糖,释放出被半纤维素等包裹的蛋白质,为后面酱油曲种的生长繁殖提供良好的碳源和氮源,本文即对此进行了研究和探讨。本发明克服了上述种种难题,提供了一种以棕榈粕为原料制备酱油的工艺。其中,选择使用工程菌毕赤酵母X33/pGAPZαAxa0-man26A培养液预处理棕榈粕基于以下考虑:(1)棕榈粕的蛋白质为外部纤维素类物质所包裹,而非淀粉多糖占42%,其中甘露聚糖更高达78%,这些难以利用的物质造成米曲霉在棕榈粕上生长繁殖不良。用表达甘露聚糖酶的毕赤酵母培养液处理棕榈粕,利用高活性的甘露聚糖酶水解甘露聚糖生成甘露寡糖,一方面解除了外部纤维素类物质屏障,使蛋白质等释放,为米曲霉生长繁殖提供丰富的氮源,另一方面生成的甘露寡糖能被毕赤酵母所利用,毕赤酵母在增殖过程中又表达甘露聚糖酶继续水解甘露聚糖,形成了一个良性循环。同时,生成的甘露寡糖也为米曲霉生长繁殖提供了良好的碳源。(2)酵母一般不分泌蛋白酶,所以毕赤酵母增殖不会利用消耗棕榈粕的蛋白质,除少部分为米曲霉生长繁殖所利用外,棕榈粕绝大部分蛋白质能用于酱油发酵中。本发明具有以下有益效果:本发明提供了一种棕榈粕制备酱油的工艺,利用表达β-甘露聚糖酶的工程菌毕赤酵母X33/pGAPZαAxa0-man26A培养液来处理棕榈粕,将处理的棕榈粕再接种米曲霉,制备酱油。所得酱油氨基酸态氮含量为1.100g/100mLxa0~1.156g/100mL,超过特级酱油30%(酿造酱油GB/T18186-2000);全氮含量为1.90g/100mL~1.99g/100mL;氨基酸生成率为56.38%~60.63%,氨基酸生成率处于酿造酱油较高的水平。本发明所述酱油制备工艺扩展了棕榈粕的应用,由于氨基酸消化率高于xa085%,安全性高,产量大、价格低廉,甘露聚糖水解产物―甘露寡糖属于功能性低聚糖,具有一定的免疫原性,非常适合推广工业应用,实现其价值最大化。xa0
附图说明
图1为毕赤酵母产甘露聚糖酶培养液先作用棕榈粕48h,再接种米曲霉培养48h的表观图片。图2为毕赤酵母产甘露聚糖酶培养液先作用棕榈粕48h,再接种米曲霉培养72h的表观图片。图3为对照(未加表达甘露聚糖酶的毕赤酵母培养液作用的棕榈粕),接种米曲霉培养72h的表观图片。图4为对照(未加表达甘露聚糖酶的毕赤酵母培养液作用的棕榈粕),接种米曲霉培养120h的表观图片。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,本发明所用试剂和材料均为市购。以下实施例所用工程菌毕赤酵母X33/pGAPZαA-man26,以及沪酿3.042号米曲霉均为华南师范大学生命科学学院生物工程发酵实验室保藏。工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A培养基:斜面培养基(g/L):槐豆胶xa020g,蛋白胨xa010g,酵母粉xa010g,琼脂xa020g。发酵培养液(g/L):葡萄糖xa050g,酵母膏xa00.5g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁1g。沪酿3.042号米曲霉培养基:斜面培养基:200g马铃薯,葡萄糖20g,琼脂20g,1000mL水。发酵培养基:棕榈粕(广州博仕奥生物技术有限公司)。实施例11、利用毕赤酵母工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入上述发酵培养液50mL,接种工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,培养84h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.95mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入10%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:按照0.07%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养48h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。2、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.100g?100mL;全氮含量(TN)为1.95g?100mL;氨基酸生成率为56.38%。实施例21、利用毕赤酵母工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入发酵培养液50mL,接种工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,培养84h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.85mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入20%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:按照0.07%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养48h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。2、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.140g?100mL;全氮含量(TN)为1.99xa0g?100mL;氨基酸生成率为57.27%。实施例31、利用毕赤酵母工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入发酵培养液50mL,接种工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,培养66h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.75mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入30%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:按照0.07%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养48h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。xa0xa0xa0xa02、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.114g?100mL;全氮含量(TN)为1.97xa0g?100mL;氨基酸生成率为56.55%。实施例41、利用毕赤酵母工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入发酵培养液50mL,接种工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,培养48h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.65mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入40%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:按照0.07%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养48h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。2、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.135g?100mL;全氮含量(TN)为1.95xa0g?100mL;氨基酸生成率为58.06%。实施例51、利用毕赤酵母工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入发酵培养液50mL,接种工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,培养48h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.55mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入50%质量比的S1的毕赤酵母培养液中,混匀,于29±1°C培养36h;S4.制曲:按照0.07%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养48h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。2、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.150g?100mL;全氮含量(TN)为1.96xa0g?100mL;氨基酸生成率为58.50%。实施例61、利用毕赤酵母工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入发酵培养液50mL,接种工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,培养66h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.75mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入30%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:按照0.05%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养72h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。xa0xa0xa0xa02、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.156g?100mL;全氮含量(TN)为1.97g?100mL;氨基酸生成率为58..60%。实施例71、利用毕赤酵母工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A,以棕榈粕为原料制备酱油,步骤如下:S1.获得能够表达β-甘露聚糖酶的酵母培养液工程菌X33/xa0pGAPZαAxa0-man26A摇瓶培养:250mL锥形瓶中装入发酵培养液50mL,接种工程菌X33/pGAPZαAxa0-man26A斜面2~3环,29±1°C,250rpm,发酵66h。S2.棕榈粕原料处理:称取棕榈粕,以棕榈粕干料计,加入0.75mL/g的水,混匀润水40min,1.1~1.3kg/cm²蒸煮30min,趁热摇散、摊凉、冷却。S3.接种:以棕榈粕干料计,向S2处理过的棕榈粕中接入30%质量比的S1的毕赤酵母培养液,混匀,于29±1°C培养48h;S4.制曲:按照0.09%的质量比,接种沪酿3.042号米曲霉种曲,混匀,于30±1°C继续培养36h,制得成曲;S5.发酵:加入成曲重量2.5倍的20°Be?盐水于S4成曲中,天然晒制发酵60天;S6.成品:将S5发酵后的酱醪淋油,获得S5中所加盐水质量60%的头油,再80°C保温30min,静置沉淀5天,过滤,得到成品酱油。xa0xa0xa0xa02、对制备得到的酱油进行质量指标检测,结果显示,氨基酸态氮含量(AN)为1.152g?100mL;全氮含量(TN)为1.90xa0g?100mL;氨基酸生成率为60.63%。